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Jun 27, 2023

Uma célula

Relatórios Científicos volume 13, número do artigo: 14123 (2023) Citar este artigo Detalhes das métricas A enzima conversora de angiotensina II (ACE2) é uma monocarboxipeptidase expressa em vários tecidos e

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 14123 (2023) Citar este artigo

Detalhes das métricas

A enzima conversora de angiotensina II (ECA2) é uma monocarboxipeptidase expressa em múltiplos tecidos e sua catálise de peptídeos bioativos regula o sistema renina-angiotensina, mediando a homeostase da pressão arterial. O ACE2 está implicado em uma variedade de doenças, incluindo obesidade, diabetes e doenças cardiovasculares, e é o receptor de entrada obrigatório para a infecção por SARS-CoV-2. Variantes genéticas da ECA2 associadas a doenças estão sendo cada vez mais identificadas, mas são mal caracterizadas. Para ajudar neste problema, introduzimos um ensaio fluorométrico baseado em células para avaliar a atividade catalítica de ACE2 expressa na superfície que preserva a glicosilação nativa do ambiente hospedeiro e é passível de análise de alto rendimento de variantes de ACE2 em placas de múltiplos poços. Demonstramos sensibilidade para detectar a catálise dos principais substratos da ECA2, Angiotensina II, Apelina-13 e des-Arg9-bradicinina, e o impacto de uma variante da ECA2 com deficiência catalítica. A normalização de medidas catalíticas para a expressão de superfície de ACE2 é responsável pela variabilidade na transfecção da variante de ACE2, distribuição de superfície ou estabilidade. Este ensaio fornece uma abordagem conveniente e poderosa para investigar as características catalíticas das variantes da ECA2 envolvidas nas cascatas de peptídeos cardiovasculares e na homeostase de múltiplos órgãos.

A enzima conversora de angiotensina 2 (ECA2) é uma proteína transmembrana integral tipo I com atividade monocarboxipeptidase que é expressa na superfície celular de uma ampla diversidade de tipos de células e tecidos, incluindo pulmão, fígado, intestino delgado, tecido adiposo, rim, coração e até certo ponto no cérebro1,2. O ACE2 é melhor reconhecido como um regulador crítico do sistema renina-angiotensina (SRA), onde regula a homeostase da pressão arterial convertendo o vasoconstritor Angiotensina II (Ang II) no vasodilatador Angiotensina (1–7) (Ang1-7) removendo seu fenilalanina terminal1,3,4. Funcionalmente, a ECA2 se opõe às ações da enzima de conversão da angiotensina (ECA), que converte a angiotensina I em angiotensina II, levando a efeitos vasoconstritores, inflamatórios e fibróticos através do receptor AT11,3. O aumento de Ang1-7 mediado pela ECA2 promove sinalização melhorada através do receptor AT1-7/Mas, que tem efeitos vasodilatadores, antiinflamatórios e antifibróticos sistêmicos no epitélio pulmonar e em outras células do corpo5,6,7. Além desses efeitos bem caracterizados sobre a Ang II, a ACE2 processa e desativa os peptídeos bioativos Apelina e des-Arg9-bradicinina (des-Arg9-BK) independente da via RAS8. A apelina funciona principalmente como um vasodilatador sistêmico, resultando na redução da pressão arterial, mas demonstrou causar vasoconstrição em alguns tipos de tecidos9,10, enquanto o des-Arg9-BK sinaliza através do receptor de bradicinina-1, promovendo efeitos pró-inflamatórios e vasodilatadores11. A ACE2 tem sido associada a vários estados de doença, incluindo obesidade12, diabetes13,14 e doenças cardiovasculares15,16,17, infecção por COVID-1918,19, comorbidades associadas a resultados ruins de COVID-1920,21,22,23, bem como longo -haul fisiopatologia do COVID-194. Dado o grande número de polimorfismos da ECA2 na população em geral24,25,26 e a implicação recente de variantes de nucleotídeo único da ECA2 e doenças14,27,28,29, são necessários métodos e ensaios biológicos de alto rendimento para examinar a relação entre o genótipo da ECA2 e função e suas ligações potenciais com a suscetibilidade e expressão de doenças.

A atividade da monocarboxipeptidase da ACE2 pode ser avaliada usando medidas baseadas em fluorometria da clivagem da fenilalanina em substratos Ang II e Ap-13, que tem sido usada para avaliar a atividade catalítica do ACE230 solúvel e recombinante. Com base nestes métodos, apresentamos um ensaio para a função catalítica da ACE2 baseada na ACE2 da superfície celular em células cultivadas num contexto de transfecção transitória. Nossa abordagem preserva a glicosilação específica para humanos do ambiente hospedeiro nativo e é favorável para avaliação de alto rendimento de grandes bibliotecas de variantes de ACE2. Demonstramos a sensibilidade do ensaio à catálise dos substratos Angiotensina II (Ang II), Apelina-13 (Ap-13) e des-Arg9-BK, inibição por inibidores específicos da ECA2 e avaliação de uma variante da ECA2 sem atividade catalítica. Uma característica importante deste ensaio é um marcador 3xHA para expressão de superfície de ACE2 que é usado para normalizar medições de catálise, permitindo a avaliação de bibliotecas de variantes de ACE2 através de transfecção aguda e para acomodar variantes de ACE2 com entrega ou estabilidade de superfície alterada.